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Die Chromatographie ist ein Trennungsprozess, bei dem ein Protein (oder ein anderer löslicher Analyt) zwischen einer unlöslichen stationären Phase und einer mobilen Phase , die über seine Oberfläche verläuft, aufgeteilt wird. Ein einfaches, aber vollständiges Chromatographiesystem ist in der folgenden Abbildung dargestellt.
t m : Die Zeit, die die mobile Phase benötigt, um die gesamte Länge der Säule zurückzulegen. Wenn Ihre Säule beispielsweise ein Gesamtvolumen von 100 ml hat und die stationäre Phase 40 ml einnimmt, nimmt die mobile Phase 60 ml ein. Wenn die mobile Phase mit einer Geschwindigkeit von 5 ml / min fließen würde, würde es 12 min dauern, bis sich die mobile Phase vom Injektor zum Detektor durch die Säule bewegt. Der t m kann manchmal bestimmt werden, indem zu Beginn des Chromatogramms ein kleiner Peak identifiziert wird, der aus einem geringfügig anderen Lösungsmittel in der mobilen Pause resultiert, die von der injizierten Probe stammt. Die t mkann auch durch Überprüfen der Elutionszeit einer Probe bestimmt werden, die von der stationären Phase überhaupt nicht zurückgehalten wird. Im Fall eines Kationenaustauscherharzes könnte ein negativ geladenes Protein verwendet werden, um die t m zu bestimmen . Es sollte auch beachtet werden, dass andere Faktoren, einschließlich der Länge und des Durchmessers der Schläuche, die den Injektor und den Detektor mit der Säule verbinden, die t m -Werte beeinflussen können.
Wenn ein Analyt irgendeiner Art einer Chromatographie unterzogen wird, bewegt er sich mit der gleichen Geschwindigkeit wie die mobile Phase, wenn er sich in der mobilen Phase befindet, und er ist stationär, wenn er an die stationäre Phase gebunden ist. Mit anderen Worten, alle Analyten verbringen in der mobilen Phase Zeit, die t m entspricht . Unterschiede in der Zeit, die sie an die stationäre Phase gebunden verbringen, ermöglichen es ihnen, voneinander getrennt zu werden.
t r : die Retentionszeit oder die Zeit, die ein Protein benötigt, um von einer Säule zu eluieren.
t r ‘: die angepasste Retentionszeit, die die Zeit beschreibt, die das Protein während einer Trennung an die stationäre Phase gebunden hat.
k ‘: Der Kapazitätsfaktor kann durch die folgende Gleichung bestimmt werden. k ‘wird verwendet, um das chromatographische Verhalten eines Analyten auf derselben Säule zu vergleichen, wenn er an zwei verschiedene Systeme gebunden ist. In diesem Fall können die t m -Werte variieren, aber die k’-Werte sollten gleich bleiben. Der Kapazitätsfaktor gibt auch die Anzahl der Säulenvolumina der mobilen Pause an, die zum Eluieren eines Analyten verwendet werden müssen. Ein k’-Wert von 1 gibt an, dass 2 Spaltenvolumina der mobilen Phase verwendet werden müssen, während ein ak’-Wert von 5 angibt, dass 6 Spaltenvolumina verwendet werden müssen.
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